一、前言

  c.内毒素测定

(一)安全性评价

发文单位:国家药品监督管理局

对于异体来源的干细胞制剂或经体外复杂操作的自体干细胞制剂,须通过免疫缺陷动物体内致瘤试验,检验细胞的致瘤性。

  6.该研究或制品相关的临床试验安全性和有效性资料;

除特殊情况外,应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性血清,不得使用同种异体人血清或血浆。如必须使用动物血清,应确保其无特定动物源性病毒污染。严禁使用海绵体状脑病流行区来源的牛血清。

  ④基因表达盒序列分析:插入的目的片段以及调控序列进行测序分析。

间充质干细胞(Mesenchymal stromal/stem cell,
MSC):一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等),具有多向分化潜力,非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能,并具有独特的细胞因子分泌功能。

  ④细胞冻融后的质控

食品药品监管总局办公厅

  ②病毒转导效率和病毒的产量等的检定

  1. European Pharmacopeia-Method 5.2.3-Cell substrates for the production
    of vaccines for human use.

  2. WHO – Recommendations for the evaluation of animal cell cultures as
    substrates for the manufacture of biological medicinal products and for
    the characterization of cell banks (2010).

  3. FDA Guidance for Industry-Characterization and Qualification of Cell
    Substrates and other Biological Materials Used in the Production of
    Viral Vaccines for Infectious Disease Indications (2010)

  4. ICH Guidelines-Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products
    Derived from Cell lines of Human or Animal Origin-Q5A(R1)-1999.

  5. ICH Guidelines-Derivation and Characterization of Cell Substrates
    Used for Production of Biotechnological/Biological Products-Q5D-1997.

  6. Dominici M., et al. Minimum criteria for defining multipotent stem
    cells-The ISCT position statement.2006;8(4):315-317(2006).

  7. ISSCR Guidelines for clinical translation of stem cells (2008)

  8. FDA Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy (1998)

  9. 亚洲城ca88com,FDAGuidance-Content and review of CMC information for human somatic
    cell therapy IND application (2008)

  10. FDA Guidance-Potency Tests for Cellular and Gene Therapy (2011).

  11. FDA Guidance for Industry-Current Good Tissue Practice (CGTP) and
    Additional Requirements for Manufactures of Human Cells, Tissues, and
    Cellular and Tissue-Based Products (HCT/Ps).

  12. EMA Guideline on human cell-based medicinal products (2007)

  5.该研究或制品相关的动物试验安全性和有效性资料;

参考文献:

  4.以基因工程化的细胞为最终制品者,包括exvivo及其它形式的基因治疗。该类制品应参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》进行。详细说明细胞扩增的全部制备工艺,包括生产流程、所用培养液及其配制方法、细胞收集、细胞的exvivo转染方法及筛选。洗涤最终制品中所用的保存液配方。

应根据新的干细胞基础及实验技术研究成果,针对各自干细胞制剂的特性、特定的临床适应证,研发新的快速检验方法,用于干细胞制备过程各阶段的质量控制和制剂的放行检验。

  除外基因表达盒序列分析,其它检定内容按上述工程菌主种子细胞库的检定。

3.王军志等。《生物技术药物研究开发和质量控制》(第二版),科学出版社,2007.

  应根据生产工艺及成品的添加成份,对有潜在危险性的成份进行残留量检测。

生长因子依赖性的检测:在培养生长因子依赖性的干细胞时,需对细胞生长行为进行连续检测,以判断不同代次的细胞对生长因子的依赖性。若细胞在传代过程中,特别是在接近高代次时,失去对生长因子的依赖,则不能再继续将其视为合格的干细胞而继续培养和使用。

  (四)制品的质量控制

责任编辑:winema

  (7)异常毒性试验

1.《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》(2003)

  c.装量

(三)干细胞制剂的检验

  ⑤上清液中的细菌、热原质及其它外源因子等。

文  号:国卫办科教发〔2015〕46号

  病毒比滴度(比活性IU),病毒感染滴度/病毒颗粒数(IU/VP)应高于3.3%。

多能性(Multipotent):是指具有形成机体内超过一种类型细胞的能力,但往往是针对特定细胞系列的。

  3.所用基因导入系统和方法的研究现状和进展;

名词解释:

  若需用其它辅助病毒,须说明其来源、分离的方法步骤和传代次数等。

应依据现行版《中华人民共和国药典》中的生物制品无菌试验和支原体检测规程,对细菌、真菌及支原体污染进行检测。

  必须充分重视伦理学的原则,并具体按国家药品监督管理局GCP规定的要求严格实施。包括在实施本方案前,须向病人说明该治疗方案属试验阶段,它可能的有效性及可能发生的风险,同时保证病人有权选择该方案治疗或中止该方案治疗,以及保证一旦中止治疗能得到其它治疗的权利。严格保护病人的隐私。在病人及家属充分理解并签字后才能开始治疗。

干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则

  9.本研究或制品的先进性和创新点;

(9)生物学效力试验

  b.热原质实验

采用不同的细胞生物学活性检测方法,如活细胞计数、细胞倍增时间、细胞周期、克隆形成率、端粒酶活性等,判断细胞活性及生长状况。

  ⑥上清液中牛血清蛋白残留量。

(10)培养基及其他添加成分残余量的检测

  3.非病毒型重组质粒DNA复(混)合物作为最终制品者,要求需详述。

可通过合适的动物试验模型观察干细胞制剂各种可能的毒性反应,如细胞植入时和植入后的局部和整体的毒性反应。

  (1)制备和生产条件及环境说明。强调基因治疗制品的制备和生产须按GMP要求进行,特别是对exvivo方式的细胞制品和重组病毒制品。临床前研究和临床研究用的重组病毒制品应该在经验证的(validatable)生产工艺途径下制备。

在动物致瘤性试验不能有效判断致瘤性时,建议检测与致瘤性相关的生物学性状的改变,如细胞对生长因子依赖性的改变、基因组稳定性的改变、与致瘤性密切相关的蛋白(如癌变信号通路中的关键调控蛋白)表达水平或活性的改变、对凋亡诱导敏感性的改变等,以此来间接判断干细胞恶性转化的可能性。

  ④复制型病毒(RCR)的检测。由于逆转录病毒或RCR具有

各省、自治区、直辖市卫生计生委、食品药品监管局,新疆生产建设兵团卫生局、食品药品监管局,国家卫生计生委直属有关单位,食品药品监管总局直属有关单位:

  ②半成品检定

应依据现行版《中华人民共和国药典》中的内毒素检测规程,对内毒素进行检测。

  (2)以exvivo形式用逆转录病毒转化的细胞(同体或异体)制品的质量控制

(6)内毒素检测

  1.所用基因的研究现状和进展;

干细胞是一类具有不同分化潜能,并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞治疗是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入(或植入)人体,用于疾病治疗的过程。这种体外操作包括干细胞的分离、纯化、扩增、修饰、干细胞(系)的建立、诱导分化、冻存和冻存后的复苏等过程。用于细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞及诱导的多能性干细胞(iPSC)。成体干细胞包括自体或异体、胎儿或成人不同分化组织,以及发育相伴随的组织(如脐带、羊膜、胎盘等)来源的造血干细胞、间充质干细胞、各种类型的祖细胞或前体细胞等。

  (二)本研究或制品的知识产权情况。包括:1)本研究或制品的知识产权情况阐述;2)本研究或制品的知识产权检索报告和检索结果。知识产权情况的阐述和检索应包括所用基因、载体、重组体、终产品的其它成分、生产用细胞和生产工艺等。

1.2 致瘤性和促瘤性

  b.病毒颗粒数测定

1.1 生长活性和状态

  (3)对异种细胞,必须提供该异种细胞在体内存活的时间及其安全性的依据。

(四)干细胞制剂的质量研究

  ①菌种同一性鉴定:菌种/株的来源、基因型及表型。基因型通

由于大多数间充质干细胞制剂具有相对的弱致瘤性,建议在动物致瘤性试验中,针对不同类型的干细胞,选择必要数量的细胞和必要长的观察期。

  详细说明基因治疗所用的目的基因及其来源(尤其是有否涉及国内外专利问题,应有专利查询资料),获得目的基因的材料方法和基因鉴定结果。

非预期分化包括非靶细胞分化或非靶部位分化。建议利用特定的检测技术,在体内动物试验中研究、评估和监控干细胞非预期分化的可能性。

  鉴于某些细胞产品,有效期较短,而有些项目的检查须较长的时间(如支原体),这些试验项目可对每批最终产品作留样检查,而该检测结果将为产品的质控提供完整的资料。若留样检查发现阳性结果,应及时对生产过程作检查,对已发放的产品立即采取措施停止使用。

三.干细胞制剂的临床前研究

  冻融后细胞上清液中的下列检测结果:

如难以采用相关动物评价人干细胞的毒性,可考虑尽可能模拟临床应用方式,采用动物来源相应的干细胞制剂,以高于临床应用剂量回输动物体内,观察其毒性反应。

发布日期:2003-3-20

3.干细胞制剂的制备工艺

  (5)中国药品生物制品检定所或由国家药品监督管理局指定的单位对一批制品的检定报告。

2.《中华人民共和国药典》2010版,第三部。

  4.该研究或制品相关的体外有效性实验资料;

(二)干细胞制剂的制备

  整合入人细胞染色体的特性,有遗传性毒性,因此对制品中RCR的检测要严格进行和严格要求。

www.ca888.com,2.动物模型

  ②菌种培养纯度检定:外源因子(如杂菌、真菌、噬菌体等)的检测。

(一)安全性评价

  2.以重组病毒作为基因治疗制品者,要求必须建立种子病毒库和工作病毒库。工作病毒库直接从种子病毒库病毒接种细胞传代制备。需详细描述病毒库的来源、建立、克隆性,传代和保存条件和方法。其质量控制方法和标准见本指导原则有关部分。须从工作细胞库细胞复苏,传代成生产细胞开始工艺过程,不得用非细胞库来源的细胞直接进行生产。做重组病毒制品时,须使用工作病毒库的病毒去感染生产细胞,不得用非病毒库来源的病毒直接进行生产。可以使用贴壁细胞或悬浮细胞大规模培养技术。病毒库可以不经过纯化而直接从细胞裂解液来制备。制剂配方也十分重要,不合适的制剂配方会影响制品活性和保存期限。

可通过检测干细胞分化潜能、诱导分化细胞的结构和生理功能、对免疫细胞的调节能力、分泌特定细胞因子、表达特定基因和蛋白等功能,判断干细胞制剂与治疗相关的生物学有效性。

  详细说明克隆步骤,材料方法;DNA序列分析图谱和结果,注明启动子、增强子、插入顺序、目的基因及polyA顺序等;重组体的限制性酶切图谱和鉴定结果;重组体中基因表达水平和时程。

目前国内外已开展了多项干细胞(指非造血干细胞)临床应用研究,涉及多种干细胞类型及多种疾病类型。主要疾病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(GVHD)、脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。其中许多干细胞类型,是从骨髓、脂肪组织、脐带血、脐带或胎盘组织来源的间充质干细胞,它们具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力等。

  若为逆转录病毒上清液,须测定:

3.致瘤性

  h.效力试验

由专业细胞检验机构/实验室进行干细胞制剂的质量复核检验,并出具检验报告。

  (三)基因治疗制品制备和生产工艺

胚胎干细胞(Embryonic stem
cell):源自第5-7天的胚胎中内细胞团的初始(未分化)细胞,可在体外非分化状态下“无限制地”自我更新,并且具有向三个胚层所有细胞分化的潜力,但不具有形成胚外组织(如胎盘)的能力。

  ③菌种稳定性检定:转化菌的比例,扩增条件、质粒拷贝数,基因表达量、允许的传代次数。

对干细胞制剂特别是异体来源、经体外传代培养和特殊处理的自体或异体来源的制剂,应当通过体外及动物试验评价其异常免疫反应,包括对不同免疫细胞亚型及相关细胞因子的影响。对胚胎干细胞及iPS细胞,在体外诱导分化后重新表达供体的HLA抗原分子,植入体内后可能形成的免疫排斥反应,需进行有效评价。

  基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式,分为体外基因导入(exvivo)及体内基因导入(invivo)两种形式。前者是在体外将基因导入人细胞,然后将该细胞注入人体。其制品形式是外源基因转化的细胞,适合在具有专门技术人才和GMP条件的医疗单位进行。后者则是将基因通过适当的导入系统直接导入人体,包括病毒的与非病毒的方法。其制品形式是基因工程技术改造的病毒或者是重组DNA、或者是DNA复(混)合物。基因治疗制剂种类较多,因此,本指导原则不可能用一个模式来概括,只能提出一个共同的原则,具体的方案应根据这些原则,确定研究技术路线。其基本原则:一是必须确保安全与有效,要充分估计可能遇到的风险,并提出相应的质控要求;二是要促进基因治疗的研究,并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求,可有一定的灵活性,应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。目前,一些基因治疗研究相对比较成熟,而一些则不够完善,更加要求研究者在使用该技术指导原则时不可生搬硬套。为此,研究者应加强咨询和论证,提出一个科学可行的研究方案,最终获得确保安全有效的基因治疗制品。

(8)致瘤性

  冻融后细胞存活数、基因表达或转导基因的活性。

为确保制剂的质量及其可控性,干细胞制剂的检验可分为质量检验和放行检验。质量检验是为保证干细胞经特定体外处理后的安全性、有效性和质量可控性而进行的较全面质量检验。放行检验是在完成质量检验的基础上,对每一类型的每一批次干细胞制剂,在临床应用前所应进行的相对快速和简化的细胞检验。

  对用于改变机体免疫状态的目的基因及其导入系统(如瘤苗、导入细胞因子基因或输入基因工程化的免疫细胞),更需提供它所引起的机体免疫改变以及可能的副作用的资料(参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》)。

4.非预期分化

亚州城娱乐官网手机版,  ①病毒滴度

应当通过细胞形态、遗传学、代谢酶亚型谱分析、表面标志物及特定基因表达产物等检测,对不同供体及不同类型的干细胞进行综合的细胞鉴别。

  ③成品检定

2.干细胞制剂稳定性研究及有效期的确定

  (5)细胞种类均一性的监控。对瘤苗类制品,应提供如何去除非肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性的依据。若从肿瘤组织中分离非肿瘤细胞(如淋巴细胞),则必须提供消除肿瘤细胞的方法、步骤及其可靠性(包括致癌试验在内)的依据。

2.异常免疫反应

  k.残留量测定

亚全能性(Pluripotent):是具有形成机体各种类型细胞,即所有三胚层来源细胞的能力,但不具有形成胚外胎组织细胞的能力。

  (2)主细胞库

每一干细胞制剂都须具有包括供者信息在内的、明确的细胞制备及生物学性状信息。作为细胞制备信息中的重要内容之一,需提供干细胞的获取方式和途径以及相关的临床资料,包括供者的一般信息、既往病史、家族史等。既往史和家族史要对遗传病(单基因和多基因疾病,包括心血管疾病和肿瘤等)相关信息进行详细采集。对用于异体干细胞临床研究的供者,必须经过检验筛选证明无人源特定病毒(包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)的感染,无梅毒螺旋体感染。必要时需要收集供者的ABO血型、HLA-I类和II类分型资料,以备追溯性查询。如使用体外授精术产生的多余胚胎作为建立人类胚胎干细胞系的主要来源,须能追溯配子的供体,并接受筛选和检测。不得使用既往史中患有严重的传染性疾病和家族史中有明确遗传性疾病的供者作为异体干细胞来源。

  a.物理检查

1.干细胞制剂质量检验的基本要求

  (5)热原质试验

项目申请者应根据上述质量检验各项目中所明确的检验内容及标准,针对每一类型干细胞制剂的特性,制定放行检验项目及标准。放行检验项目应能在相对短的时间内,反映细胞制剂的质量及安全信息。

  若有些方案在动物中难以观察其疗效(如种族差异),应充分提供有效性的间接或旁证资料或依据。

前体细胞(Precursors):一类只能向特定终末分化细胞分化的,较祖细胞更有限的增殖能力的成体细胞。

  需说明来源、代数、细胞特性及有关档案资料。对主细胞库和工作细胞库需详细说明建库过程,包括材料、方法、步骤、细胞库存的数量和登记档案等。

三、干细胞制剂的临床前研究

  (2)DNA结构检测

(7)异常免疫学反应

  (2)工程菌工作种子库的检定

用于体外培养和建立胚胎干细胞及iPS细胞的人源或动物源的滋养层细胞,需根据外源性细胞在人体中使用所存在的相关风险因素,对细胞来源的供体、细胞建立过程引入外源致病微生物的风险等进行相关的检验和质量控制。建议建立滋养层细胞的细胞库,并按细胞库检验要求进行全面检验,特别是对人源或动物源特异病毒的检验。

  (3)工作细胞库

2015年7月31日

  2.工程菌库

(二)干细胞制剂的制备

  4.一般临床指标和实验室检测。

1.毒性试验

  b.病毒颗粒数测定

国家卫生计生委办公厅

  工程菌主种子库和工作种子库的建立和检测应按现行《中国药典》相关要求建立。

随着研究的进展,建议针对临床治疗的适应证,不断研究更新生物学效应检测方法。如研究介导临床治疗效应的关键基因或蛋白的表达,并以此为基础提出与预期的生物学效应相关的替代性生物标志物(Surrogate
Biomarker)。

  (6)复制型病毒的检测,若应用病毒型导入系统必须严格检查复制型病毒。

诱导的多能性干细胞(Induced pluripotent stem cell,
iPS):一类通过基因转染等细胞重编程技术人工诱导获得的,具有类似于胚胎干细胞多能性分化潜力的干细胞。

  6.靶组织和非靶组织的分子生物学检测。

(4)无菌试验和支原体检测

  ③目的基因存在状态、表达及其稳定性。尤其要说明对基因及其载体导入后是否出现基因“插入性突变”及其观察方法及结果。

对高代次的或经过体外复杂处理和修饰的自体来源以及各种异体来源的干细胞制剂,应当进行临床前研究阶段动物致瘤性评估。建议选择合适的动物模型,使用合适数量的干细胞、合理的植入途径和足够长的观察期,以有效评价制剂的致瘤性。

  7.可能产生的副作用或不良反应的记录,建立实施治疗方案中的事故报告制度。

为确保干细胞治疗的安全性和有效性,每批干细胞制剂均须符合现有干细胞知识和技术条件下全面的质量要求。制剂的检验内容,须在本指导原则的基础上,参考国内外有关细胞基质和干细胞制剂的质量控制指导原则,进行全面的细胞质量、安全性和有效性的检验。同时,根据细胞来源及特点、体外处理程度和临床适应证等不同情况,对所需的检验内容做必要调整。另外,随着对干细胞知识和技术认识的不断增加,细胞检验内容也应随之不断更新。

  ③病毒转导基因的活性

应制定干细胞制剂制备工艺的标准操作流程及每一过程的标准操作程序(SOP)并定期审核和修订;干细胞制剂的制备工艺包括干细胞的采集、分离、纯化、扩增和传代,干细胞(系)的建立、向功能性细胞定向分化,培养基、辅料和包材的选择标准及使用,细胞冻存、复苏、分装和标记,以及残余物去除等。从整个制剂的制备过程到输入(或植入)到受试者体内全过程,需要追踪观察并详细记录。对不合格并需要丢弃的干细胞制剂,需对丢弃过程进行规范管理和记录。对于剩余的干细胞制剂必须进行合法和符合伦理要求的处理,包括制定相关的SOP并严格执行。干细胞制剂的相关资料需建档并长期保存。

  i.复制型病毒(RCA)检测

为确保制剂工艺和质量的稳定性,须对多批次干细胞制剂进行质量检验;在制备工艺、场地或规模等发生变化时,需重新对多批次干细胞制剂进行质量检验。制剂的批次是指由同一供体、同一组织来源、同一时间、使用同一工艺采集和分离或建立的干细胞。对胚胎干细胞或iPS细胞制剂,应当视一次诱导分化所获得的可供移植的细胞为同一批次制剂。对需要由多个供体混合使用的干细胞制剂,混合前应视每一独立供体或组织来源在相同时间采集的细胞为同一批次细胞。

  (六)基因治疗的安全试验

1.培养基

  (八)伦理学考虑

针对不同类型的干细胞制剂,根据对输入或植入人体前诱导分化的需求,须对未分化细胞和终末分化细胞分别进行必要的检验。对胚胎干细胞和iPS细胞制剂制备过程中所使用的滋养细胞,根据其细胞来源,也需进行针对相关风险因素的质量控制和检验。

  a.无菌试验

用于观察植入的干细胞或其分化产物改变模型中疾病的病理进程;研究干细胞的归巢能力和免疫调节功能;通过分析干细胞植入后,特定细胞因子和/或特定基因表达情况,提出替代性生物学效应标志物。

  d.化学检定:pH值

(一)干细胞的采集、分离及干细胞(系)的建立

  若为释放病毒的细胞,须测定:

2.细胞检验

生效日期:1900-1-1

3.快速检验方法的研发

  (6)过敏试验

在干细胞的采集、分离及干细胞(系)建立阶段,应当对自体来源的、未经体外复杂操作的干细胞,进行细胞鉴别、成活率及生长活性、外源致病微生物,以及基本的干细胞特性检测。而对异体来源的干细胞,或经过复杂的体外培养和操作后的自体来源的干细胞,以及直接用于临床前及临床研究的细胞库(如工作库)中的细胞,除进行上述检测外,还应当进行全面的内外源致病微生物、详细的干细胞特性检测,以及细胞纯度分析。干细胞特性包括特定细胞表面标志物群、表达产物和分化潜能等。

  l.无菌试验

应制定干细胞采集、分离和干细胞(系)建立的标准操作及管理程序,并在符合《药品生产质量管理规范》(GMP)要求基础上严格执行。标准操作程序应包括操作人员培训;材料、仪器、设备的使用和管理;干细胞的采集、分离、纯化、扩增和细胞(系)的建立;细胞保存、运输及相关保障措施,以及清洁环境的标准及常规维护和检测等。

  (1)原始细胞库

应对制剂制备的全过程,包括细胞收获、传代、操作、分装等,进行全面的工艺研究和验证,制定合适的工艺参数和质量标准,确保对每一过程的有效控制。

  包括包装和繁殖重组病毒的细胞库和扩增重组质粒的工程菌库。必须建立三级库,即原始细胞库(PrimarySeedBank)、种子细胞库(MasterCellBank)和工作细胞库(WorkingCellbank);或原始工程菌库、种子工程菌库和工作工程菌库。

发布日期:2015-7-31

  根据目前国内外的进展和完善程度,这里以重组腺病毒(rAd)制品制品来描述重组病毒基因治疗制品的质量控制,其它的重组病毒制品可参考这些质控要点。

应对制剂制备过程中残余的、影响干细胞制剂质量和安全性的成分,如牛血清蛋白、抗生素、细胞因子等进行检测。

  2.非病毒型重组DNA基因治疗制品

为尽量减少不同批次细胞在研究过程中的变异性,研究者在干细胞制剂的制备阶段应对来源丰富的同一批特定代次的细胞建立多级的细胞库,如主细胞库(Master
Cell Bank)和工作细胞库(Working Cell
Bank)。细胞库中细胞基本的质量要求,是需有明确的细胞鉴别特征,无外源微生物污染。

执行日期:2003-3-20

2.干细胞采集、分离及干细胞(系)建立阶段质量控制的基本要求

  (3)制备和生产过程控制。在生产过程中,一些步骤必须进行监测,并要求有监测记录。

名词解释

  2.分子遗传学的评估

(一)干细胞的采集、分离及干细胞(系)的建立

  g.病毒滴度测定

成体干细胞(Somatic stem
cell):位于各种分化组织中未分化的干细胞,这类干细胞具有有限的自我更新和分化潜力。

  (一)DNA重组体或基因导入系统的构建

为加强我国干细胞制剂和临床研究质量管理,国家卫生计生委与食品药品监管总局根据《干细胞临床研究管理办法(试行)》,共同组织制定了《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》(可从国家卫生计生委或食品药品监管总局网站下载)。现印发给你们,请遵照执行。

  二、研究内容和制品质量控制

二.干细胞制剂的质量控制

  1.细胞库

干细胞制剂(Stem cell-based medicinal
products):是指用于治疗疾病或改善健康状况的、以不同类型干细胞为主要成分、符合相应质量及安全标准,且具有明确生物学效应的细胞制剂。

  病毒颗粒数测定,采用A260紫外吸收法测定。

(2)存活率及生长活性

  c.冻融后细胞的异常毒性试验。

对于由不同供体或组织来源的、需要混合使用的干细胞制剂,需对所有独立来源的细胞质量进行检验,以尽可能避免混合细胞制剂可能具有的危险因素。

  (9)有害物质残余量的测定

(二)有效性评价

  (1)工程菌主种子库的检定

对间充质干细胞,无论何种来源,应进行体外多种类型细胞(如成脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞等)分化能力的检测,以判断其细胞分化的多能性(Multipotency)。对未分化的胚胎干细胞和iPS细胞,须通过体外拟胚胎体形成能力,或在SCID鼠体内形成畸胎瘤的能力,检测其细胞分化的多能性(Pluripotency)。除此以外,作为特定生物学效应试验,应进行与其治疗适应证相关的生物学效应检验。

  2.体内试验

自体来源的干细胞供者,根据干细胞制剂的特性、来源的组织或器官,以及临床适应证,可对供体的质量要求和筛查标准及项目进行调整。

  重组病毒制品的稳定性试验:需对保存条件、保存液配方及至少对三批样品进行稳定性考察。应进行不同温度及反复冻融对活性影响的研究。

生效日期:2015-7-31

  (二)细胞库及工程菌库的建立和检定

在临床前研究方案中,应设计和提出与适应证相关的疾病动物模型,用于预测干细胞在人体内可能的治疗效果、作用机制、不良反应、适宜的输入或植入途径和剂量等临床研究所需的信息。

  (4)细胞库检定

(四)干细胞制剂的质量研究

  (7)添加物:除细胞培养及保存所用的试剂外,某些exvivo或invivo导入基因或细胞时,需要加用其它添加物,对此类物质必须有动物实验证明其安全性。

(三)干细胞制剂的检验

  (4)致癌试验。无论是自体或异体细胞,经基因操作后,均须作致瘤试验。对于瘤苗类制品,必须提供该瘤细胞经过何种处理能有效地阻止继续增殖的证据。致癌试验包括软琼脂细胞生长及裸鼠内致癌试验。

1.细胞模型(见前述-干细胞制剂的质量研究)

  1.提供申报单位符合GMP生产条件的证明。

对于需要混合使用的干细胞制剂,需对各独立细胞来源之间细胞表面标志物、细胞活性、纯度和生物学活性均一性进行检验和控制。

  ①原液检定:

3.干细胞制剂的质量复核

  ②活细胞比例和细胞浓度。

若使用商业来源培养基,应当选择有资质的生产商并由其提供培养基的组成成分及相关质量合格证明。必要时,应对每批培养基进行质量检验。

  b.外观

应在合适的动物模型基础上,研究和建立干细胞有效标记技术和动物体内干细胞示踪技术,以便于研究上述内容,特别是干细胞的体内存活、分布、归巢、分化和组织整合等功能的研究。在综合动物模型研究基础上,应对干细胞制剂的安全性和生物学效应进行合理评价。

  ②病毒结构检定

(5)细胞内外源致病因子的检测

  7.该研究或制品的生产工艺现状;

胚胎干细胞系(Embryonic stem cell
line):在体外培养的条件下,可保持未分化状态连续增殖的胚胎干细胞。

  具有感染能力病毒颗粒的测定,采用TCID50法。〖ZK)〗

祖细胞(Progenitors):一类只能向特定细胞系列分化,并且只具备有限的分裂增殖能力的成体细胞。

  3.明确给药的方式、剂量、时间及疗程。如需通过特殊的手术导入治疗制剂,须提供详细的操作过程。

一.前言

  3.毒性反应的评估

二、干细胞制剂的质量控制

  4.基因导入系统构建包括病毒载体与非病毒载体基因导入系统。

本指导原则提出了适用于各类可能应用到临床的干细胞(除已有规定的造血干细胞移植外)在制备和临床前研究阶段的基本原则。每个具体干细胞制剂的制备和使用过程,必须有严格的标准操作程序并按其执行,以确保干细胞制剂的质量可控性以及治疗的安全性和有效性。每一研究项目所涉及的具体干细胞制剂,应根据本指导原则对不同阶段的基本要求,结合各自干细胞制剂及适应证的特殊性,准备并实施相关的干细胞临床前研究。

  无论病毒型与非病毒型载体系统,均需注意进入体内后的免疫反应有关的问题,包括过敏反应、排斥反应以及机体的自身免疫反应(如对裸DNA)等,并对可能发生的免疫反应提出相应的监控及处理措施。

滋养层细胞(Feeder
layer):是指通过细胞-细胞相互作用,或分泌蛋白或其他物质,位于胚胎干细胞和iPS细胞的培养底层,以支持这些干细胞生长的动物源性或人源性细胞。

  (2)脂质体的来源和性质,或者制备方法

若培养基中含有人的血液成份,如白蛋白、转铁蛋白和各种细胞因子等,应明确其来源、批号、质量检定合格报告,并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品。

  A549细胞检测法,每3.0×1010VP中应不高于1RCA(即≤1RCA/3.0×1010VP)

2.1 质量检验

  8.随访的计划及实施办法。

2.滋养层细胞

  (七)基因治疗临床试验方案

根据干细胞制剂稳定性试验结果,确定其制剂的保存液成份与配方、保存及运输条件、有效期,同时确定与有效期相适应的运输容器和工具,以及合格的细胞冻存设施和条件。

  2.载体

应进行干细胞制剂在储存(液氮冻存和细胞植入前的临时存放)和运输过程中的稳定性研究。检测项目应包括细胞活性、密度、纯度、无菌性等。

  1.一般要求

1.干细胞制剂的质量及特性研究

  对质控合格的基因治疗制剂,须提供以下安全性试验的资料:

参考文献

  5.病人及家属的同意书

(1)细胞鉴别

  按2000年版《中国生物制品规程》附录《生物制品无菌试验规程》进行。

若所申请的研究方案,因目前国际上干细胞生物学知识和技术方面的局限性,无法提出有效的体内动物模型研究内容,则应在临床前研究报告中进行全面细致的说明。

  a.无菌试验

畸胎瘤(Teratoma):一种含有三个胚层组织细胞和分化的组织的良性肿瘤。

  (2)非病毒基因导入系统除裸DNA外,一般包括两个部分:一是哺乳动物细胞表达载体;二是其它载体物质,如脂质体、多肽或金属粒子等。为此,需说明目的基因导入系统的性质与内容。由于部分病人对青霉素的过敏反应,最好不用耐氨苄青霉素基因作耐药基因,而建议用卡那霉素或新霉素基因作耐药基因。若用物理方法导入,须提供其详细方法、步骤,基因导入效率及其表达的生物活性以及导入细胞后基因的稳定性,无重排或突变的证据。每一操作步骤必须鉴定其结果,通常的鉴定内容和方法有:限制性酶切图谱,基因的PCR扩增,表达盒DNA序列分析,SDS-PAGE,Westernblot分析等。

造血干细胞(Hematopoietic stem
cell):具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞,可分化成红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞。

  (1)重组质粒DNA的生产制备和质控

在满足上述干细胞制剂质量检验要求的基础上,建议在临床前和临床研究各阶段,利用不同的体外实验方法对干细胞制剂进行全面的安全性、有效性及稳定性研究。

  靶组织和非靶组织的分子免疫学检测。若导入重组病毒或可能改变机体免疫状态的制剂,须针对性地提供观察人体免疫学方面的相关检测指标及对可能发生的免疫学反应的必要处理措施。

(3)纯度和均一性

  通过基因枪等物理和化学方法将基因导入人体者,需说明目的基因的制备、表达、裸DNA大量扩增、分离、纯化,仪器设备的性能和详细的导入方法。

(二)有效性评价

  4.免疫学的评估

通过检测细胞表面标志物、遗传多态性及特定生物学活性等,对制剂进行细胞纯度或均一性的检测。对胚胎干细胞及iPS细胞植入人体前的终末诱导分化产物,必须进行细胞纯度和/或分化均一性的检测。

  m.异常毒性试验

检测异体来源干细胞制剂对人总淋巴细胞增殖和对不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响,或对相关细胞因子分泌的影响,以检测干细胞制剂可能引起的异常免疫反应。

  a.无菌试验

1.对干细胞供者的要求

  (1)国内外研究现状和进展(综述)。包括:

全能性(Totipotent):是早期数天胚胎中,具有分化成机体所有类型细胞和形成完全胚胎能力的干细胞。

  5.致癌试验:见本指导原则相关部分。

目前,普遍认为间充质干细胞“不致瘤”或具有“弱致瘤性”,但不排除其对已存在肿瘤的“促瘤性”作用。因此,建议根据各自间充质干细胞制剂的组织来源和临床适应证的不同,设计相应的试验方法,以判断其制剂的“促瘤性”。

  e.支原体检查。

1.3 生物学效应

  ③导入基因的存在状态,稳定性及其表达水平的检测

用于干细胞治疗的细胞制备技术和治疗方案,具有多样性、复杂性和特殊性。但作为一种新型的生物治疗产品,所有干细胞制剂都可遵循一个共同的研发过程,即从干细胞制剂的制备、体外试验、体内动物试验,到植入人体的临床研究及临床治疗的过程。整个过程的每一阶段,都须对所使用的干细胞制剂在细胞质量、安全性和生物学效应方面进行相关的研究和质量控制。

  这是安全性试验的重要组成部分。invivo的方案必须提供毒性反应的详细资料。除目的基因可能导致的毒性外,导入系统的安全性评价至为重要,其安全性评估应包括急性毒性(最大耐受量)及长期毒性试验。毒性试验所用的剂量,除包括相当于临床使用剂量(按体重或表面积计算)外,尚需有一个较大的剂量范围。剂量范围应包括大于临床使用剂量以确定最大耐受量。给药途径应尽可能模拟临床给药或导入的形式。若改变途径须说明其原因及依据。毒性反应的观察,除常规检测项目外。应包括与基因治疗相关的检测指标。

应结合体内和体外方法,根据每一细胞制剂的特性进行人源及动物源性特定致病因子的检测。如使用过牛血清,须进行牛源特定病毒的检测;如使用胰酶等猪源材料,应至少检测猪源细小病毒;如胚胎干细胞和iPS细胞在制备过程中使用动物源性滋养细胞,需进行细胞来源相关特定动物源性病毒的全面检测。另外还应检测逆转录病毒。

  (4)无菌试验

2.2 放行检验

  工作细胞库由主细胞库传代建立。应明确工作细胞库的使用代次。

应进行干细胞制剂的临床前研究,为治疗方案的安全性和有效性提供支持和依据。

  (1)重组腺病毒(rAd)作为基因治疗制品的质量控制

(试行)

  c.具有感染能力病毒颗粒的测定(病毒活性)

发文单位:国家卫生和计划生育委员会办公厅
国家食品药品监督管理总局办公厅

  根据基因治疗类制品的生产工艺特点,其质量控制的原则主要是:检定项目尽可能在成品中进行;如成品中的添加成份影响检定结果,则需在原液中进行。

鉴于干细胞治疗的特殊性,其临床前的安全有效性评价具有较大难度和局限性,以下只提出一些基本的原则,具体的研究方案可根据这些原则制定。如进行的相关研究工作与下述原则不符,应提供相应的依据和支持性资料。

  限制性酶切图谱鉴别

干细胞制剂制备所用的培养基成分应有足够的纯度并符合无菌、无致病微生物及内毒素的质量标准,残留的培养基对受者应无不良影响;在满足干细胞正常生长的情况下,不影响干细胞的生物学活性,即干细胞的“干性”及分化能力。在干细胞制剂制备过程中,应尽量避免使用抗生素。

  非病毒型基因导入系统,均需一个能在人体细胞表达目的基因的质粒。除裸露DNA外,还须附加其它的组分进行加工,如脂质体、多肽、金属颗粒等。本指导原则不包括寡聚核苷酸(如AntisenseRNA,Ribozyme,RNAi等)类基因治疗制品。

  f.纯度:可采用A260nm/A280nm值法或HPLC法

  8.该研究或制品的质量控制现状;

  采用PCR法,应无腺相关病毒(AAV)的污染。

  1.总体安全性评估

  e.鉴别试验

  须证明该外源基因导入细胞后,能表达并能达到治疗效果的依据。若属exvivo,须提供该细胞中目的基因的表达量及细胞导人体内后预期的效果。

  在向国家药品监督管理局申报临床试验时,除须按本指导原则中“研究内容和制品质量控制”准备材料外,同时需提供下述材料:

  除了在质控中已规定的各项要求外,对于exvivo用基因工程化的自体或异体细胞导人体,应提供以下资料:

  (2)详细的制备和生产工艺方法、材料和技术路线。

  10.本研究或制品产业化的可行性。综述内容须科学客观。

  一、引言

  有效性试验包括:

  ①细胞形态、表面标志、染色体组型及其同一性。

  1.治疗用的目的基因

  3.DNA重组体

  (5)重组质粒DNA复(混)合物终制品的生产制备和质控

  对invivo的治疗方案,必须提供动物体内重组病毒或重组DNA制品导入靶组织与非靶组织的分布情况、基因的表达情况。对于exvivo的方案。须提供导入基因的细胞进入体内后的活性和目的基因的表达情况和分布。

  包括载体DNA的限制性内切酶图谱或基因库资料。若有特殊的元件,如启动子、增强子及PolyA位点等,应提供详细资料。若有改变结构(如丢失片段,点突变或插入片段),须提供DNA测序结果。若属新的或改变结构的病毒载体,须提供组建的材料、方法、组建步骤及鉴定结果的全部资料。

  (1)生长因子的依赖性细胞,对其生长行为必须予以监检。若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖性,不能再予以使用。

  基因治疗不同于一般生物技术制品的临床应用,首先是它的复杂性,例如对于exvivo方式,需有经验的临床单位和专家将制品输入或埋入人体的特定组织,甚至通过手术进行操作;二是它的风险性,尚存在许多未知的因素,须对临床研究的全过程进行严密监控,并在申请临床研究时须提供下列资料:

  n.内毒素检测

  j.腺相关病毒的检测

  (3)多肽的来源和性质,或者合成方法

  (4)一批制品生产的原始制造及检定记录。

  该类制品应参照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》进行。应特别注意复制型病毒的检测。检测的范围,包括前述种子细胞库、工作细胞库,生产后细胞及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的5%。生产病毒后细胞取样量须达每批中1%或108细胞(取少的)。检测方法应包括至少5代的细胞共培养扩增(如用Musdunni细胞),随后须用PG4S+/L-法、标记挽救法或RT/PCR中的两种方法来检测。必须用阳性对照(COS4070A上清液)及阴性对照作严格定量标化,证明其敏感性及可靠性。PCR应利用放射性同位素杂交或同样敏感的系统。

  (1)纯度:超螺旋型的含量,细菌基因组DNA、RNA和蛋白残留量。

  ④复制型病毒的检测

  2.提供临床研究单位和直接参与研究人员的名单和简历。

  基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于体细胞。

  插入基因检测

  过RAPD方法鉴定,通过测定重组质粒的特殊标记和抗药性标记确定表型。

  提供动物实验结果证明在体内靶组织中基因导入的效率、表达状态及可达到治疗的目的。证明在非靶组织器官中基因表达的分布。动物种类根据实验模型的需要而定。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。由于小动物对某些途径(如动脉插管)有一定困难,若改变导入途径须说明原因及依据。

  (8)介导目的基因的活性检测

  主细胞库由原始细胞库直接传代建立或通过亚克隆方法筛选后建立。应明确使用代次。

  插入基因表达活性测定

  (五)基因治疗的有效性试验

  2.所用载体的研究现状和进展;

  1.体外试验

  对于exvivo方案,对瘤苗类或淋巴细胞、巨噬细胞类等自体细胞的导入,一般可免做动物急性和长期毒性试验。但若加入特殊的添加物(如明胶、缝线、特殊的导管等),以及对于某些重要人体脏器内导入(如心、脑、肝等),必须作动物体内毒性作用的试验,并提供详细资料。若exvivo方案添加细胞因子,亦必须提供其安全性的资料。对采用皮肤、皮下、肌肉给药途径的方案,无论是exvivo或invivo均需提供局部刺激性的资料。

  d.病毒转导基因活性。

文  号:国药监注[2003]109号

  (2)对同种异体细胞的移植,必须从免疫学方面提供其安全性依据。

  (4)其它成分的来源和性质,或者制备方法

  1.重组病毒作为基因治疗制品的质量控制

  (3)脂质体、多肽或金属粒子等的来源和性质。由于脂质体的形成及多肽类合成过程的随机性,不可能达到一般化学合成物的均一性及纯度,为此应提供不同批号间保证安全有效的可以达到的最大均一性的程度。

  (1)病毒载体基因导入系统包括腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体基因导入系统等。需详细描述形成单克隆原始病毒颗粒的方法、材料、技术路线和全部的鉴定方法、标准和结果。这些鉴定一般包括:结构鉴定(限制性酶切图谱和PCR分析)、整个病毒的序列分析(≤40kb),基因体外表达和生物活性,SDS-PAGE、表达盒DNA序列分析、Westernblot分析、转染效率、透射电镜负染法观察、复制型病毒的检测和其它污染因子的检测。

  ①主细胞库或工作细胞库检定应依据《生物制品生产用细胞的制备及检定规程》的要求进行。

  插入基因的生物学活性测定

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